USE OF A PCR-RFLP MOLECULAR TEST FOR THE DIFFERENTIATION OF Babesia bovis AND Babesia bigemina IN THE DIAGNOSIS OF BOVINE BABESIOSIS
Este estudo teve como objetivo avaliar a capacidade diagnóstica de um teste de PCR para detecção de Babesia spp, baseado em oligonucleotídeos gênero-específicos que amplificam uma porção da pequena subunidade do gene do RNA ribossômico (18S rDNA), bem como na determinação da espécie por digestão do produto de amplificação com enzimas de restrição (PCR-RFLP). A extração de DNA de Babesia spp foi obtida de eritrócitos infectados usando um kit comercialmente disponível. A amplificação do DNA foi realizada com uma master mix de PCR usando como primers oligonucleotídeos direcionados a uma região variável do gene 18S rDNA. Os produtos de PCR amplificados foram digeridos com as enzimas de restrição (ER) Hinc II, ScrF I, Msp I, Acu I, Nla III e Box I. Os produtos de PCR amplificados e digeridos com ER foram visualizados por eletroforese em géis de agarose a 3%. O teste de PCR permitiu a amplificação de um fragmento de DNA de ≈ 400 pb. Amplicons digeridos com ER ScrF I e Msp I apresentaram fragmentos de 250 e 150 pb em amostras contendo DNA de B. bovis, enquanto amplicons de amostras infectadas com B. bigemina não foram digeridos. Os amplicons digeridos com ER Acu I e Box I apresentaram fragmentos de 290 e 110 pb nas amostras infectadas com B. bigemina, enquanto nas amostras infectadas com B. bovis o amplicon de 400 pb não foi digerido. Portanto, o teste de PCR-RFLP poderia ser utilizado para diferenciar as espécies de Babesia que infectam eritrócitos bovinos de acordo com o resultado do padrão obtido após a digestão de RE. Além disso, amplicons digeridos com ER Hinc II, fragmentos de 330 e 65 pb são produzidos nas amostras infectadas com B. bovis, mas não nos amplicons obtidos em amostras infectadas com B. bigemina. Assim, o teste de PCR-RFLP visando o gene 18S rDNA pode ser uma ferramenta diagnóstica útil para confirmar o estado de infecção da babesiose bovina e a discriminação de espécies na fase aguda da doença.
USE OF A PCR-RFLP MOLECULAR TEST FOR THE DIFFERENTIATION OF Babesia bovis AND Babesia bigemina IN THE DIAGNOSIS OF BOVINE BABESIOSIS
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DOI: 10.37572/EdArt_26022379816
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Palavras-chave: Babesia bovis, Babesia bigemina, PCR-RFLP
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Keywords: Babesia bovis, Babesia bigemina, PCR-RFLP
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Abstract:
This study aimed to evaluate the diagnostic capacity of a PCR test to detect Babesia spp, based on genus-specific oligonucleotides that amplify a portion of the small subunit ribosomal RNA gene (18S rDNA), as well as on the species determination by digestion of the amplification product with restriction enzymes (PCR-RFLP). Babesia spp DNA extraction was obtained from infected erythrocytes using a commercially available kit. DNA amplification was performed with a PCR master mix using as primers oligonucleotides targeting a variable region of the 18S rDNA gene. The amplified PCR products were digested with the restriction enzymes (RE) Hinc II, ScrF I, Msp I, Acu I, Nla III, and Box I. The amplified and RE-digested PCR products were visualized by electrophoresis on 3% agarose gels. The PCR test allowed the amplification of a DNA fragment of ≈ 400 bp. Amplicons digested with RE ScrF I and Msp I showed fragments of 250 and 150 bp in samples containing B. bovis DNA, while amplicons of samples infected with B. bigemina were not digested. Amplicons digested with RE Acu I and Box I showed fragments of 290 and 110 bp in samples infected with B. bigemina, while in samples infected with B. bovis the 400 bp amplicon was not digested. Therefore, the PCR-RFLP test could be utilized to differentiate the Babesia species that infect bovine erythrocytes according to the pattern result obtained after RE digestion. In addition, in amplicons digested with RE Hinc II, fragments of 330 and 65 bp are produced in the samples infected with B. bovis, but not in the amplicons obtained in samples infected with B. bigemina. Thus, the PCR-RFLP test targeting the 18S rDNA gene may be a useful diagnostic tool to confirm the bovine babesiosis infection status and species discrimination in the acute phase of the disease.
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Número de páginas: 19
- Julio Vicente Figueroa Millan
- José Juan Lira Amaya
- Diego Jesús Polanco Martínez
- Rebeca Montserrat Santamaría Espinosa
- Grecia Martínez García
- Carmen Rojas Martínez
- Jesús Antonio Álvarez Martínez